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植物提取物常見的5種檢測方法

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植物提取物常見的5種檢測方法

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2019/01/08
【摘要】:
目前植物提取物的檢測方法常見的有五種,分別為:高效液相色譜分析法(HPLC)、紫外吸收光譜分析法(UV)、薄層色譜分析法(TLC)、氣相色譜分析法(GC)和原子吸收光譜分析法(AAS)。  每一種方法的作用原理和應用都各不相同。其中,HPLC和UV為標準植物提取物的常用檢測方法,TLC被用于比例植物提取物的檢測,GC用來檢測揮發性液體或油類,AAS用于提取物重金屬含量的檢測。??  1、高效液相色
 
  目前植物提取物的檢測方法常見的有五種,分別為:高效液相色譜分析法(HPLC)、紫外吸收光譜分析法(UV)、薄層色譜分析法(TLC)、氣相色譜分析法(GC)和原子吸收光譜分析法(AAS)。
  每一種方法的作用原理和應用都各不相同。其中,HPLC和UV為標準植物提取物的常用檢測方法,TLC被用于比例植物提取物的檢測,GC用來檢測揮發性液體或油類,AAS用于提取物重金屬含量的檢測。
 
 
  1、高效液相色譜分析法(HPLC)
  HPLC全程是High Performance Liquid Chromatography(高效液相色譜法),又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支,以液體為流動相,采用高壓輸液系統,將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內各成分被分離后,進入檢測器進行檢測,從而實現對試樣的分析。該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。高效液相色譜法(HPLC)是20世紀60年代后期發展起來的一種分析方法。近年來,在保健食品功效成分、營養強化劑、維生素類、蛋白質的分離測定等應用廣泛。世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來分析測定。
  1.1高效液相色譜分析的流程
  由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統,然后輸出,經流量與壓力測量之后,導入進樣器。被測物由進樣器注入,并隨流動相通過色譜柱,在柱上進行分離后進入檢測器,檢測信號由數據處理設備采集與處理,并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似,不同的是氣相色譜改變溫度,
  而HPLC改變的是流動相極性,使樣品各組分在最佳條件下得以分離。
  1.2高效液相色譜的分離過程
  同其他色譜過程一樣,HPLC也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。
  開始樣品加在柱頭上,假設樣品中含有3個組分,A、B和C,隨流動相一起進入色譜柱,開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留,較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時間長,較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介于A,C之間,第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統,則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱,達到分離之目的。
  不同組分在色譜過程中的分離情況,首先取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異,這是熱力學平衡問題,也是分離的首要條件。其次,當不同組分在色譜柱中運動時,譜帶隨柱長展寬,分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。
 
 
  2、紫外吸收光譜分析法(UV)
  UV檢測法也是植物提取物常用的檢測方法之一,UV是英文名稱ultraviolet的縮寫,UV檢測也稱紫外檢測法、紫外光譜檢測法。UV檢測法主要用于配合物組成及其穩定常數的測定,定量分析結構分析定性分析應用范圍定義紫外光譜是分子中某些價電子吸收了一定波長的電磁波,由低能級躍近到高能級而產生的一種光譜當分子中的電子吸收能量后會從基態躍遷到激發態,然后放出能量(輻射出特征譜線),回到基態;而輻射出特征普線的波長在紫外區中就叫做紫外光譜(UV)
  紫外光來自于一個水銀紫外燈,水銀紫外燈是通過藍寶石窗口以及過程流來獲取的。除了特定的紫外波長,狹窄的波段通過紫外過濾器阻塞了所有的傳輸光線。這些紫外光能夠通過過濾器以及測試探測器只記錄特定的紫外波長。
  紫外光直接通過靠近燈的相同規格的紫外過濾器。參考探測器置于過濾器后邊,可以測試出當前的紫外強度。參考探測器信號用于彌補由于燈管老化,極端溫度變化等引起的紫外資源強度的起伏變化。通過測量及參考探測器給到的光電流結果將會通過傳送器進行放大,修改,處理。傳送器實時的提供經計算后的測量結果,且能夠向處理控制系統發送多個輸出值。
  2.1 UV定性分析
  在有機化合物的定性分析中,紫外-可見光譜適用于不飽和有機化合物,尤其是共軛體系的鑒定,以此推斷未知物的骨架結構。此外,可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質譜法進行定性鑒定和結構分析,因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。一般有兩種定性分析方法,比較吸收光譜曲線和用經驗規則計算最大吸收波長λmax,然后與實測值進行比較。結構分析??結構分析可用來確定化合物的構型和構象。如辨別順反異構體和互變異構體。
  2.2 UV定量分析
  紫外-可見分光光度定量分析的依據是Lambert-Beer定律,即在一定波長處被測定物質的吸光度與它的溶度呈線性關系。應此,通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度可求出該物質在溶液中的濃度和含量。種常用的測定方法有:單組分定量法、多組分定量法、雙波長法、示差分光光度法和導數光譜法等。配合物組成及其穩定常數的測定??測量配合物組成的常用方法有兩種:摩爾比法(又稱飽和法)和等摩爾連續變化法(又稱Job法)。酸堿離解常數的測定??光度法是測定分析化學中應用的指示劑或顯色劑離解常數的常用方法,該法特別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。
 
 
  3、薄層色譜分析法(TLC)
  薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示,又稱薄層層析,屬于固-液吸附色譜。是近年來發展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法,它兼備了柱色譜和紙色譜的優點。一方面適用于小量樣品(幾到幾十微克,甚至0.01μg)的分離;另一方面若在制作薄層板時,把吸附層加厚,將樣品點成一條線,則可分離多達500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發性較小或在較高溫度易發生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外,在進行化學反應時,常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失來判斷反應是否完成。
  薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板(10×3cm左右)上均勻的涂一層吸附劑或支持劑,帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點線上,涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內,浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時,將色譜板取出,干燥后噴以顯色劑,或在紫外燈下顯色。薄層色譜又叫薄板層析,是色譜法中的一種,是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術,屬固—液吸附色譜,它兼備了柱色譜和紙色譜的優點,一方面適用于少量樣品(幾到幾微克,甚至0.01微克)的分離;另一方面在制作薄層板時,把吸附層加厚加大,因此,又可用來精制樣品,此法特別適用于揮發性較小或較高溫度易發生變化而不能用氣相色譜分析的質。此外,薄層色譜法還可用來跟蹤有機反應及進行柱色譜之前的一種“預試”。
 
 
  4、氣相色譜分析法(GC)
  GC:Gas Chromatography氣相色譜法用氣體作為移動相的色譜法。根據所用固定相的不同可分為兩類:固定相是固體的,稱為氣固色譜法;固定相是液體的則稱為氣液色譜法。
  氣相色譜系統由盛在管柱內的吸附劑,或惰性固體上涂著液體的固定相和不斷通過管柱的氣體的流動相組成。將欲分離、分析的樣品從管柱一端加入后,由于固定相對樣品中各組分吸附或溶解能力不同,即各組分在固定相和流動相之間的分配系數有差別,當組分在兩相中反復多次進行分配并隨移動相向前移動時,各組分沿管柱運動的速度就不同,分配系數小的組分被固定相滯留的時間短,能較快地從色譜柱末端流出。以各組分從柱末端流出的濃度c對進樣后的時間t作圖,得到的圖稱為色譜圖。當色譜過程為沖洗法方式時,組分在進樣后至其最大濃度流出色譜柱時所需的保留時間tR,與組分通過色譜柱空間的時間tM,及組分在柱中被滯留的調整保留時間t惱的關系是:
  式中t惱與tM的比值表示組分在固定相比在移動相中滯留時間長多少倍,稱為容量因子k:
  從色譜圖還可以看到,從柱后流出的色譜峰不是矩形,而是一條近似高斯分布的曲線,這是由于組分在色譜柱中移動時,存在著渦流擴散、縱向擴散和傳質阻力等因素,因而造成區域擴張。在色譜柱內固定相有兩種存放方式,一種是柱內盛放顆粒狀吸附劑,或盛放涂敷有固定液的惰性固體顆粒〔載體或稱擔體(表2)〕;另一種是把固定液涂敷或化學交聯于毛細管柱的內壁。用前一種方法制備的色譜柱稱為填充色譜柱,后一種方法制備的色譜柱稱為毛細管色譜柱(或稱開管柱)。
  通常借用蒸餾法的塔片概念來表示色譜柱的效能,例如使用“相當于一個理論塔片的高度“H或“塔片數”n來表示柱效。對于填充柱:
  對于開管柱:
  式中λ是與填充均勻性有關的因素,稱為填充不規則因子;γ是柱內填充物使得氣體擴散路徑彎曲的因素,稱為彎曲因子;dp是填充物平均顆粒直徑(即粒度);u是載氣在柱溫、柱壓下的線速;Dg是組分在氣相中的分子擴散系數;Dl是組分在液相的擴散系數;df是固定液的液膜厚度;dc是開管柱的內徑。所以色譜柱的塔片數n=L/H,式中L為色譜柱長;n的數值可用給定的物質作實驗,由實驗所得到的色譜圖(圖1)計算得到:
  式中ω┩為色譜峰的半高寬,由于氣相色譜的組分在固定液中的分配等溫線多為線性,如果進樣量很小,得到的色譜峰流出曲線最初是用高斯正態分布來描述的,其數學表示式為:
  現在實驗和理論上都證明了物質的色譜峰形狀是不對稱的和曳尾的,若用指數衰減修正的高斯分布作為描述色譜峰形狀的分布函數,則更為確切:
  式中A表示峰面積;tG表示高斯峰的中心位置;σ表示高斯峰的標準方差;τ表示指數衰減函數的時間常數;t′為積分變量。
  上面曾經指出,兩組分的分配系數必須有差異,其色譜峰才能被分開。有了差異,分離時所需的柱效n也就不相同,所以要判別兩色譜峰分離的情況(圖2),還需要采用色譜柱總分離效能指標R:
  n與R的關系為:
  式中α′是組分相對保留值;α是組分校正相對保留值。從上式可知,選擇適宜固定液和具有給定塔片數的色譜柱后,應該通過改變色譜柱溫來調節α′值,從而滿足將兩組分分離至給定R值的分離程度。
 
 
  5、原子吸收光譜法(AAS)
  原子吸收光譜法(AAS),全稱是Atomic Absorption Spectrometry
  AAS基本原理:
  每一種元素的原子不僅可以發射一系列特征譜線,也可以吸收與發射線波原子吸收光譜原理圖
  長相同的特征譜線。當光源發射的某一特征波長的光通過原子蒸氣時,即入射輻射的頻率等于原子中的電子由基態躍遷到較高能態(一般情況下都是第一激發態)所需要的能量頻率時,原子中的外層電子將選擇性地吸收其同種元素所發射的特征譜線,使入射光減弱。特征譜線因吸收而減弱的程度稱吸光度A,與被測元素的含量成正比:式中K為常數;C為試樣濃度;I0v為原始光源強度;Iv為吸收后特征譜線的強度。按上式可從所測未知試樣的吸光度,對照著已知濃度的標準系列曲線進行定量分析。由于原子能級是量子化的,因此,在所有的情況下,原子對輻射的吸收都是有選擇性的。由于各元素的原子結構和外層電子的排布不同,元素從基態躍遷至第一激發態時吸收的能量不同,因而各元素的共振吸收線具有不同的特征。原子吸收光譜位于光譜的紫外區和可見區。
 
 
 
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